诱导多能干细胞（iPSC，简称为iPS细胞），是一种由哺乳动物成体细胞经转入转录因子等手段脱分化形成的多能干细胞，最早由日本学者山中伸弥的研究团队于2006年发现。作为研究发育或疾病分子机制的理想研究工具，识别新治疗靶点和高通量药物筛选方面的广阔应用。

虽然iPSC研究已经取得长足进步，但在后续的研究过程中，仍存在一些挑战。诱导iPSC生成的过程中，效率低、致瘤性、外源基因插入等问题仍然存在，iPSC诱导向人体组织细胞的过程中也存在成熟度不足、致瘤性风险等问题，需要培养方法的优化以及对重编程分子机制的进一步研究。要解决这一系列问题，必须通过高通量的研究发现新的靶点和培养及诱导方法，Incucyte® 实时活细胞分析系统和iQue® 高通量流式细胞仪可以满足高通量研究的需求，为iPSC研究插上腾飞的翅膀。

Incucyte® 

iQue®

Incucyte® 在iPSC研究中的应用

工欲善其事，必先利其器。在iPSC的研究过程中，在不挪动细胞的前提下，Incucyte® 可以实现长时间实时监测iPSC向特定细胞类型分化的整个分化过程中细胞特征的变化，包括细胞形态、增殖、凋亡等指标，并且一次可放6块培养板，满足高通量活细胞成像的要求。

iPSC研究大致有两个方向：

1.优化培养条件、诱导体系等以期获得更稳定的iPSC细胞系；iPSC细胞呈现克隆生长，为确定不同iPSC细胞系，哪种在后续基因编辑以及诱导中更加稳定，对各个细胞系实时监测，通过汇合度计算增殖情况。

 

候选细胞系的增殖特征：

A：Incucyte® 记录不同iPSC细胞系传代三天后的图片；B：3×104 个细胞接种48h细胞消化计数；C：使用Incucyte® 计算3个时间点汇合度（confluence）来评估iPSC增殖情况。

2.模拟疾病模型以及分化出更成熟的成体组织细胞，包括优化诱导条件以及改为3D培养等。下面两篇文献的Figure展示了向神经以及心肌细胞方向的分化：

 体外培养20天的分化神经荧光细胞簇：

在iPSC向神经细胞分化的过程中，用βIII-tubulin (TUJ1) 对未成熟神经元的聚集体进行染色，并显示从(a)阴性对照聚集体、(b)未加载的微球结合聚集体、(c)微球结合聚集体和(d)阳性对照聚集体。Incucyte® 自动拍摄36张单独图像组合而成，用 ImageJ 软件拼接和裁剪。比例尺：300 μm。

hiPSC-CM 实时凋亡信号检测

心肌分化，作者利用一种新的Metabolic Selected的诱导选择方法制备缺血性心肌病模型的心肌细胞，这种模型的心肌细胞应具备Dox毒性敏感特征。利用我们的活细胞凋亡指示剂实时检测在加入Dox后心肌细胞的死亡情况发现Annexin V+的细胞比例随Dox浓度提升死亡比例上升。

 

iQue® 在iPSC研究中的应用

 

除Incucyte® 的应用外，高通量的研究当然少不了我们的iQue® 高通量流式细胞检测仪，专为大规模筛选设计。

2020年时，阿斯利康改良Crisper-cas9技术，开发了一种ObLiGaRe强力霉素诱导型SpCas9(ODInCas9)转基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe导致人类或小鼠细胞的功能整合，最终产生ODInCas9小鼠，并且验证发现这种小鼠体细胞体内编辑可以模拟非小细胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治疗研究能够验证候选药物的功效。在判断基因编辑成功与否时，应用到Incucyte® 检测细胞增殖，并联合使用iQue® 及Incucyte® 筛选GFP阳性的细胞。

高通量筛选编辑成功的GFP阳性细胞

将各种不同组织细胞以及iPSC细胞导入OdInCas9，抗生素筛选后进行单克隆挑选培养，用Incucyte® 拍照成像，识别GFP阳性细胞，为确定是否真正导入OdInCas9，加入Dox诱导GFP表达，细胞消化后放入96孔板，用我们的iQue® 鉴别GFP阳性细胞。

除此之外， 赛多利斯对两者在iPSC中的应用做了一个简单的示例：

iPSC检测实验流程：

1.多能性检测：iQue® 检测iPSC细胞系多能性标记基因表达并用Incucyte® 检测细胞形态；

2.2D培养时，利用Incucyte® 拍照，iQue® 检测表面标记基因表达；

3.3D培养21天后，以同样方法检测。

优化培养基长期培养特征评估：

我们加入一种基础培养基以及一种优化培养基培养ATCC-DYS0100 iPSC细胞系，并检测这两种情况下的生长状况、形态以及标记基因表达（图5），可以看到阴性对照（非多能细胞）THP1细胞表达高水平SSEA-1，低表达TRA-1-60，阳性对照NCCIT细胞恰恰相反（图6 A），优化过培养基在长期培养到18天时，仍然保持着很强的多能性，而非优化培养基随着时间推移，逐渐分化。Forecyt分析软件特有的热图结果，清晰地展示18天时多能性标记基因的表达比例（图6 B），从而方便地实现大规模筛选。Incucyte® 对培养的拟胚体进行观察，发现优化过的细胞偏心度远低于未优化组，更加圆润（图6 C,D），证明优化过的培养基对于多能性的维持作用明显。

展望未来，利用iPSC这种理想研究工具，可从成千上万种的药物中，发现药物的新靶点、新作用，乃至发现新的药物，诱导出真正替代人体成体细胞成熟度的细胞。

 

为什么要用Incucyte®长时程细胞影像分析系统？

iPSC异质性强对培养条件要求苛刻，培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害。

6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高。

高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；本文提到了使用Incucyte® 多个参数的调节，使得结果更加准确。

大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol；文章数大于12000篇，是长时间活细胞成像产品中最多。

 

为什么要用iQue® 高通量流式呢？

气泡分隔的连续采样技术，使流式细胞术进入高通量筛选(HTS)领域。

最小样本体积达到10uL，支持384、1536孔板采样，96孔板只需5min。

ForeCyt软件、比起传统流式分析更简单的使用及维护，硬件配套软件，是高通量流式筛选必备仪器。虽然在文章中未提及iQue® 的高通量应用。